1、HRP標(biāo)記抗體的方法
酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對(duì)于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過(guò)碘酸鈉法。尤以簡(jiǎn)易過(guò)碘酸鈉法更為常用。
戊二醛二步法原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過(guò)其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。
2、標(biāo)記步驟
(1)稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過(guò)夜。
(2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
(3)將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時(shí)。
(5)加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。
(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)。
(7)3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8)將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測(cè))，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。
