凍存原理
當(dāng)細胞所處溫度低于0°C時，細胞脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶，冰晶的大小對細胞的影響是不同的，大冰晶容易造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂，故造成復(fù)蘇出來的細胞存活率、狀態(tài)等與凍存前的狀態(tài)相差甚遠。因此，我們在凍存細胞的時候會采取兩個措施，一加入低溫保護劑，二，慢凍細胞
凍存時機：細胞應(yīng)在生長良好、密度約為 80-90％、數(shù)目一般為 10 6 -10 7 /ml，活力差的細胞在凍存后的成活率很小。
低溫保護劑：常用的低溫保護劑是二甲基亞砜DMSO，它是一種滲透保護劑，可迅速透入細胞，提高細胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。
慢凍細胞：可以使用程序性降溫盒，緩慢凍存細胞，可使細胞內(nèi)避免產(chǎn)生大的冰晶。如果沒有程序降溫盒，可以將凍存細胞依次放于4度1h，-20度2h，-80過夜，大部分細胞也可以適應(yīng)。
凍存液配置：凍存液應(yīng)該提前配制，置于室溫備用，防止臨時配制產(chǎn)生的熱量損傷細胞（DMSO加入到培養(yǎng)基中會放熱），凍存液常規(guī)配比為培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1，如果細胞比較珍貴，可以調(diào)整為血清：DMSO=9:1。
操作步驟：
1.用移液器吸走原培養(yǎng)基，加入適量PBS洗1-2遍；
2.消化細胞：加入適量胰酶，置于培養(yǎng)箱中37°C消化（10厘米大皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5min，注意不同細胞消化時間不同，終止消化截點為鏡下觀察80%-90%以上的細胞變圓）；
3.待消化到位后加入胰酶2倍體積的完全培養(yǎng)基終止消化，800-1000rpm離心3-5min；
4.準(zhǔn)備好凍存管，標(biāo)記上日期，細胞類別，人名，代數(shù)，待細胞離心后去上清，加入凍存液重懸，每管1-1.5ml,轉(zhuǎn)移到凍存管中；
5.將凍存管放入程序降溫盒中，-80度過夜，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存。
注意事項
1、 細胞加入凍存液之后立即放入-80度保存，勿常溫放置太久
2、 凍存細胞儲存在-80度中通常不建議超過半年，液氮中通常不建議超過2年。
